Principalele metode de deteminare a antigenelor hla

Complexul major de histocompatibilitate (MHC) reprezinta un ansamblu de gene situate pe bratul scurt al cromozomului 6 la om, care codifica glicoproteine implicate in recunoasterea antigenelor de catre limfocitele T si in recunoasterea structurilor proprii si non-proprii de catre sistemul.imun. Antigenele HLA ori specificitatile HLA se definesc prin tipare serologice folosind testul de microlimfocitotoxicitate dependenta de complement (CDC), tehnica descrisa de Terasaki si Mc Clelland in 1964.

Antigenele HLA de clasa I se studiaza pe limfocite T, care pot fi izolate din sange periferic recoltat pe anticoagulant (heparina sau citrate dextroza solutia A - ACD) sau din ganglioni limfatici.

Antigenele HLA de clasa II se studiaza pe limfocite B, care pot fi izolate din sange periferic recoltat pe anticoagulant (ACD) sau din splina. Ca tehnici de izolare, se folosesc: pentru antigenele de clasa I separarea in gradient de densitate Ficoll sau cu bile imunomagnetice de clasa I, iar pentru clasa II separarea cu bile imunomagnetice de clasa II sau anticorpi monoclonali.

 TESTUL DE MICROLIMFOCITOTOXICITATE (CDC)

Metoda are la baza reactia de citotoxicitate mediata de complement si se desfasoara in doua etape: intr-o prima etapa, limfocitele sunt incubate cu antiser si in etapa ulterioara cu ser de iepure proaspat (inghetat sau liofilizat) ca sursa de complement. Legarea anticorpilor la antigenul HLA specific prezent pe membrana limfocitelor va activa complementul (calea clasica de activare), care va induce leziuni membranei celulare. Vizualizarea injuriei membranei celulare se face prin microscopie utilizand coloranti vitali, cum ar fi eozina, care patrunde in celulele lezate (microscop optic in contrast de faza) sau solutia de colorant bromura de etidiu acridin orange, care va colora in rosu celulele lezate sau in verde celulele care nu au fost lezate (microscop optic inversat cu fluorescenta). In cazul izolarii pe gradient de densitate, testul se citeste la microscopul inversat in contrast de faza, in timp ce izolarea bazata pe separare imunomagnetica cu folosirea colorantului fluorescent se citeste la microscopul cu fluorescenta.

TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARA

Aplicarea tehnicilor de biologie moleculara a dus la o modificare fundamentala a metodologiei de tipizare a antigenelor HLA. Comparativ cu tehnicile serologice  si biochimice care permit definirea si descrierea antigenelor HLA, tiparea ADN permite accesul direct la genele codante ale acestora, furnizand informatii asupra variabilitatii genetice.

Genele studiate pentru genotiparea HLA codifica moleculele polipeptidice de la suprafata membranei celulare, si anume:

4 pentru clasa I: HLA A, B, C

4 pentru clasa II: DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DQA1, DQB1, DPA1, DPB1

-100% ++++

Ca etape importante in tiparea ADN se intalnesc:

A. EXTRACTIA ADN

Extragerea se face pornind de la orice tip de cellule nucleate; recoltarea sangelui se face pe EDTA, un chelator de ioni de Mg2+, ioni necesari functionarii nucleazelor. Nu se foloseste heparina, pentru ca inhiba anumite Taq polimeraze.

B. AMPLIFICAREA

SECVENTELOR SPECIFICE

Se realizeaza prin reactia de amplificare enzimatica - POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR), care a fost denumita de Lederberg in 1993 “instrumentul pentru democratizarea biologiei moleculare”. Este o tehnica in vitro de amplificare enzimatica a unei secvente specifice din structura acidului deoxyribonucleic (ADN) si care are trei etape:

1. Denaturarea, realizata prin incalzirea probei la 95 c pentru 30-60 s, in care se obtine desfasurarea celor doua lanturi din structura dublu catenara a ADN,

2. Anelarea, in care are loc atasarea nucleotidelor sintetice la secventele complementare de la nivelul lantului ADN; aceasta etapa se realizeaza la o temperatura de 55-65 grade Celsius, intr-un interval de timp cuprins intre 30 si 45 de secunde.

3. Elongarea, in care are loc sinteza lantului AND complementar matritei, cu ajutorul polimerazei. Se realizeaza la 70-75 grade Celsius si este initiata de la extremitatea 3”-OH a fiecarui oligonucleotid sintetic (numit in literatura de specialitate primer). Timpul necesar pentru realizarea acestei etape este de la 30 la 60 de secunde. * Durata fiecarei etape si schimbarile de temperatura necesare in timpul reactiei sunt realizate automat in termocyclere destinate amplificarii. Un ciclu format din aceste trei etape dureaza intre 3 si 5 minute, fiind necesare intre 25 si 38 de cicluri pentru a obtine o amplificare. Produsul de amplificat obtinut prin PCR este analizat prin electroforeza in gel de agaroza (2%). Dupa migrare, gelul (care contine bromura de etidiu) se examineaza la UV cu ajutorul unui transiluminator. Controlul este reprezentat de un marker ADN, care permite calcularea taliei fragmentelor de restrictie cautate. PCR-SSP si PCR-SSO sunt, in mod curent, doua metode aplicate de rutina in laboratoarele de histocompatibilitate destinate transplantului renal.

TEHNICA PCR-SSP (sequence specific primers)